ايمونوبلوتينگ
پيشنهاد: قبلا روش SDS-PAGE را بايد ياد بگيريد. داونلود راهنماي آناليز وسترن بلاتينگ با نرم افزار ImageJ مقدمــه ايمونوبلوتينگ يا وسترن بلوتينگ روشي دو مرحله اي است که طي آن ابتدا باندهاي پروتئيني جدا شده بوسيله الکتروفورز از روي ژل SDS-PAGE به غشاي ديگري که غالبا از جنس نيتروسلولز مي باشد انتقال مي يابند و در مرحله دوم توسط آنتي بادي اختصاصي، پروتئين مورد نظر شناسايي مي شود. کلمه بلوتينگ به روش انتقال اشاره دارد و کلمه ايمونو به خاطر لزوم استفاده از واکنش بين آنتي ژن و آنتي بادي اختصاصي در مرحله شناسايي مي باشد. براي DNA و RNA و ليپيدها نيز روش انتقال مشابهي بکار برده مي شود که به ترتيب southern blot و northern blot و eastern blot ناميده مي شود. نيرويي که موجب انتقال مولکول پروتئين از ژل به غشاء مي شود غالبا جريان الکتريکي است اما از نيروي انتشار diffusion و از فشار مکانيکي positive pressure و از نيروي افينيتي بين آنتي ژن و آنتي بادي نيز استفاده شده است. انتقال به وسيله جريان الکتريکي را الکتروبلاتينگ نيز مي نامند. در روش ديفوزيون ساده، غشاء و ژل را رو در رو به هم مي چسبانند پروتئين با انتشار ساده به غشاي نيتروسلولز مي رسد و به خاطر خصوصيت اين غشا به آن متصل شده و متوقف مي شود و کم کم همه پروتئين موجود در ژل به غشا منتقل مي شود اين روش زمان زيادي لازم دارد. در استفاده از فشار مثبت، غشا و ژل در حد فاصل دو محفظه قرار مي گيرند که از بافر بلوتينگ پر مي شوند و معمولا به محفظه بالايي (واقع در پشت ژل) فشار ضعيف و مثبتي اعمال مي شود جريان بافر در اثر اين فشار از جانب ژل به طرف غشا برقرار مي شود و پروتئين را با خود به غشا مي رساند و در آنجا پروتئين به غشا متصل شده و متوقف مي شود در استفاده از افينيتي (FAT= filter affinity transfer) معمولاً آنتي بادي اختصاصي روي غشا وصل مي شود (براي جلوگيري از انتشار آن) و ژل در تماس با غشا قرار مي گيرد به مرور آنتي ژن موجود در ژل در اثر افينيتي آنتي بادي به غشا منتقل مي شود. علاوه بر وسترن بلاتينگ، يک روش سريع ديگري نيز براي پي بردن به وجود يک پروتئين در نمونه وجود دارد که Dot blotting گفته مي شود اما در آن عملا روش انتقال بصورت نمونه گذاري دستي صورت مي گيرد يعني نمونه (معمولا محلول) را به صورت لکه دايره اي شکل كوچكي روي غشا مي گذارند و سريعا خشک مي كنند و در صورت لزوم با فيكساتور مناسب تثبيت ميكنند. از پروتئين هاي خاص براي مسدود كردن نقاط اتصال باقيمانده استفاده ميكنند. سپس طي مرحله شناسايي پروتئين مورد نظر شناسايي مي شود. مرحله اول: انتقال پروتئين از ژل به غشاء نيتروسلولز: طي روند الكتروبلاتينگ (انتقال بوسيله جريان برق) پروتئين هاي جدا شده در ژل پلي آكريلاميد به کمک نيروي الکتريکي به غشاي ديگري از جنس نيتروسلولز و يا PVDF و ... منتقل مي شوند. براي اين كار از دستگاه الكتروبلاتينگ استفاده مي شود دستگاه الکتروبلاتينگ : اين دستگاه محفظه اي شيشه اي به شکل زير است که جايگاه ويژه اي براي فروبردن يک کاست مخصوص در آن قرار دارد (در سطح داخلي ديواره شيشه اي در دو طرف مقابل هم، دو زايده از جنس شيشه، ناودان خاصي را ايجاد مي كنند كه كاست در درون آن قرار گرفته و ثابت مي شود) در دو طرف اين جايگاه دو الکترود تعبيه شده اند جنس آند از پلاتين و فيش آن به رنگ قرمز است جنس کاتد از استيل و فيش آن سياه رنگ مي باشد جنس کاست از شيشه بوده و داراي سوراخ هاي درشت در قسمت هاي جانبي است تا جريان الکتريکي براحتي از آن عبور کند. كاست به كمك اسفنج ها، محفظه تنگ و فشرده اي را بوجود مي آورد كه از دو طرف فشار آورده و سطح رو در روي ژل با غشا را به هم نزديكتر مي كند. كاست منطقه لولا مانندي دارد كه بواسطه آن به طرفين باز مي شود. در سطح داخلي آن ابتدا دو لايه ضخيم اسفنج در طرفين قرار داده مي شود بين اين دو اسفنج از طرف کاتد (دقت شود) به ترتيب کاغذ صافي (سه برگ) و ژل و غشاي نيتروسلولزي و کاغذ صافي (سه برگ) قرار داده مي شود. غشا و کاغذ صافي ها قبلا با بافر بلوتينگ کاملا خيس مي شوند (حدود 15 دقيقه). وقتي غشاي نيتروسلولز و ژل و اسفنج و كاغذ صافي ها به طور صحيح !! در محل خود قرار داده شدند و كاست در جهتي صحيح !! در ناودان خاص خود در داخل دستگاه فرو برده شد نوبت به اتصال سيم هاي رابط مي رسد. دو الکترود دستگاه به دو جا فيش قرمز و سياه متصل هستند كه در بالاي دستگاه در معرض ديد قرار دارد. دو فيش موجود در دو انتهاي سيم رابط قرمز رنگ به جا فيش هاي قرمز رنگ موجود در دستگاه بلاتينگ و منبع تغذيه وصل مي شوند. دو فيش مشكي در دو انتهاي سيم رابط مشكي نيز به دو جافيش مشكي رنگ موجود در دستگاه بلاتينگ و منبع تغذيه وصل مي شود. وقتي از صحيح بودن جهت قرار گيري ژل به غشا (ژل به طرف كاتد و غشا به طرف آند) و صحيح بودن اتصال سيم هاي رابط مطمئن شديد وقت آن رسيده است كه منبع تغذيه روشن شود. روش کار با منبع تغذيه: منبع تغذيه طوري ساخته مي شود که مي تواند يکي از فاکتورها (ولت يا آمپر) را ثابت نگه دارد. قبل از وصل كردن منبع تغذيه به برق شهري و قبل از روشن كردن كليد آن (اگر كليدهاي تنظيم كننده ولت و آمپر از آزمايش قبلي در آخرين درجه باز مانده باشند امكان سوختن فيوز دستگاه به دليل عبور جريان زياد وجود دارد) هر دو کليد ولتاژ و شدت جريان را کاملا مي بنديم سپس دستگاه را به برق 220 ولت شهري وصل کرده و کليد دستگاه را از حالت off به حالت on در مي آوريم. سپس اگر مي خواهيم شدت جريان (آمپر) توسط دستگاه ثابت نگه داشته شود ابتدا كليد مربوط به ولتاژ را تا آخرين حد باز مي کنيم و در مرحله بعد کليد مربوط به شدت جريان را به آرامي باز مي کنيم تا شدت جريان مورد نياز تامين شود (به صفحه نمايش بالاي اين کليد که تغييرات شدت جريان را نشان مي دهد توجه کنيد و شدت جريان را آرام آرام بالا ببريد). اما اگر بخواهيم ولتاژ ثابت بماند بصورت معكوس عمل مي كنيم يعني اول كليد آمپر را تا آخر باز مي كنيم سپس كليد ولتاژ را به اندازه مورد نياز باز مي كنيم. نكته: براي بالا بردن عمر دستگاه، پس از اتمام كار، حتما هر دو كليد را در پايين ترين مقدار خود قرار دهيد و سپس آن را خاموش كنيد. نکته: پس از شروع الکتروبلاتينگ، بافر در اثر عبور جريان الکتريکي گرم مي شود در اثر آن مقاومت الکتريکي کاهش يافته و باعث افزايش شدت جريان و ولتاژ مي شود ولي دستگاه يکي از آنها را با تغيير دادن ديگري اصلاح کرده و ثابت نگه مي دارد. پس از مدت زمان معين (بسته به نوع آزمايش) وقتي كار الكتروبلاتينگ نمام شد دستگاه خاموش شده و كاست خارج مي شود سپس با احتياط كامل غشا از بقيه جدا مي شود و در يک ظرف تميز و هم اندازه و به پشت !! قرار مي گيرد تا مراحل بعدي انجام گيرد (براي جلوگيري از اشتباهات بعدي روي غشاء در يك گوشه با مداد نرم علامت گذاري مي شود). انتخاب ظرف: ظرف بكار برده شده در اين مرحله نبايد از ابعاد غشاء خيلي بزرگتر باشد چون باعث مصرف زياد معرف ها مي گردد. ظرف بايد كاملا تميز و عاري از هر گونه پروتئين باشد چون غشا در اين مرحله ميتواند به آساني پروتئين هاي موجود در محيط را به خود جذب كند. همچنين كف ظرف بايد كاملا صاف باشد در غير اين صورت حركت مداوم غشاء در داخل آن (به منظور مخلوط كردن) موجب آسيب به غشا مي گردد. شستشوي اوليه: براي حذف SDS و ذرات ريز ژل، غشاء چندين بار با بافر شستشو شسته مي شود. موقع شستشو از ريختن مستقيم محلول روي غشا جدا پرهيز كنيد (محلول شستشو و معرف ها را به آرامي و بر روي كف يا ديواره ظرف بريزيد) چون باندهاي پروتئني موجود در روي غشا سست هستند و در اثر كوچكترين فشار مكانيكي دچار پراكندگي شده و حتي ممكن است كنده شده و موقع شستشو از دسترس خارج شوند. مرحله بلوكينگ: براي پر كردن محل هاي اتصال خالي مانده (نواحي كه پروتئين براي اتصال موجود نبوده) از محلول هاي پروتئيني مخصوصي استفاده مي شود. اين كار مانع اتصال ناخواسته آنتي بادي ها به غشاء در مرحله بعدي مي شود. محلول بلوکان به ظرف حاوي غشاء اضافه شده و چند ساعت (حداقل يك ساعت و با مخلوط كردن آرام) در دماي اتاق و يا تا فردا صبح در 4 درجه (يخچال و بدون مخلوط كردن) نگهداري مي شود. از نگهداري بيش از حد غشاء در اين وضعيت پرهيز كنيد چون با اين كار در مرحله شناسايي با رنگ زمينه بالايي روبرو خواهيد شد.
نماي سطح مقطع از دستگاه الكتروبلات حاوي كاست
انتخاب غشاء:
1 - غشاي با شارژ مثبت داراي گروه آمونيوم مي
باشد و براي پروتئين هاي با بار منفي و
اسيدهاي نوکلئيک مناسب است.
رنگ روشن کننده محل باندها در روي نيتروسلولز پانسواس ميباشد و ميتوان پس از
اطمينان از محل باندها آن را با آب مقطر چندين بار شسته و مراحل بلوتينگ را ادامه
داد.
سپس پروتئين مورد نظر از بين پروتئين
هاي ديگر توسط آنتي بادي اختصاصي (مثلا موجود در سرم يک انسان) شناسايي شده
و به آن وصل مي شود در مرحله بعد آنتي
بادي دومي که در حيوان ديگري برعليه ايمونوگلوبولين انساني توليد شده و با
ماده نشاندار كننده اي کونژوگه شده به سطح غشا
اضافه مي شود ماده نشاندار معمولاً يك آنزيم
(الکالن فسفاتاز يا پراکسيداز) مي
باشد
سپس سوبستراي اختصاصي آنزيم اضافه مي شود در صورت وجود پروتئين مورد نظر در نمونه
مورد آزمايش آنتي بادي موجود در سرم فرد به آن وصل شده و آنتي
بادي دوم (کونژوگه با
آنزيم) نيز به آنتي بادي اول وصل مي شود پس از شستشو و حذف آنزيم هاي متصل نشده
سوبسترا به غشا اضافه مي شود سوبسترا در اثر آنزيم متصل شده به پروتئين، تغيير
يافته و محصول رنگي توليد مي کند محصول سوبسترا بايد غير محلول بوده و در سطح غشا
رسوب کند تا در اثر شستشو حذف نشود. براي بالا بردن حساسيت رديابي
پروتئين گاها از سوبستراهايي استفاده مي شود كه خاصيت کمي
لومينسسانس دارند براي ثبت و ظهور
آنها از فيلم هاي حساس راديولوژي استفاده مي
شود و سپس توسط دانسيتومتر
شدت نور قرائت مي گردد |
|
|
|
دفتر ترجمه ، تاليف و نشر استيار |
سلام . من دکتر مجید فاریابی فارغ التحصیل رشته دکنرای داروسازی دانشگاه علوم پرشکی کرمان و موسس داروخانه شبانه روزی دکتر مجید فاریابی هستم و این وبلاگ برای مشاوره و اطلاعات دارویی است .ممنون از بازدیدتون .